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重组血管内皮抑素对荷人食管鳞癌裸鼠VEGF—C和LYVE—1表达水平的影响

作者: | 发布时间:2022-11-10 09:00:04 | 浏览次数:


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【摘要】 目的 研究重组血管内皮抑素(ES)对荷人食管鳞癌裸鼠血管内皮生长因子-C(VEGF-C)和淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1(LYVE-1)的调节作用。方法 构建人食管鳞癌裸鼠模型, 6只瘤周皮下注射ES稀释液荷瘤裸鼠作为A组, 6只瘤周皮下注射生理盐水荷瘤裸鼠作为B组, 6只正常裸鼠作为C组, 比较三组血清LYVE-1、VEGF-C的表达水平, 观察ES对荷瘤裸鼠LYVE-1和VEGF-C基因表達的影响。结果 A、B组血清VEGF-C水平分别为(155.26±10.24)、(180.23±15.64)pg/L, 均高于C组的(103.15±13.20)pg/L, 差异具有统计学意义(P<0.01);A组血清VEGF-C水平低于B组, 差异具有统计学意义(P<0.05)。A、B组血清LYVE-1水平分别为(65.32±16.29)、(90.58±10.67)pg/L, 均高于C组的(28.31±10.36)pg/L, 差异具有统计学意义(P<0.01);A组血清LYVE-1水平低于B组, 差异具有统计学意义(P<0.05)。A、B组组织内VEGF-C、LYVE-1的PCR扩增倍数均高于C组, 差异具有统计学意义(P<0.01);A组组织内VEGF-C、LYVE-1的PCR扩增倍数低于B组, 差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 通过重组ES对TE-1食管鳞癌细胞荷瘤裸鼠干预, 重组ES不仅抑制肿瘤新生血管的生成, 而且重组ES可能通过抑制肿瘤组织内VEGF-C和LYVE-1的表达, 对肿瘤新生淋巴管的发生起到抑制作用。

【关键词】 重组血管内皮抑素;血管内皮生长因子-C;淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1;食管癌;移植瘤模型

DOI:10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.19.107

Influence by recombinant endostatin on expression levels of VEGF-C and LYVE-1 in nude mice bearing human esophageal squamous carcinoma YU Jun-yan, TIAN Xiang-yang, CHANG Jian-lan, et al. Department of Oncology, Affiliated Heping Hospital of Shanxi Changzhi Medical College, Changzhi 046000, China

【Abstract】 Objective To research regulating effect by recombinant endostatin (ES)on vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C)and lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1 (LYVE-1)in nude mice bearing human esophageal squamous carcinoma. Methods In establishment of nude mice model bearing human esophageal squamous carcinoma, there were 6 nude mice bearing tumor as group A receiving subcutaneous injection of ES diluents in peripheral tumor skin, 6 nude mice bearing tumor as group B receiving subcutaneous injection of normal saline in peripheral tumor skin, and 6 normal nude mice as group C. Comparison was made on serum expression levels of LYVE-1 and VEGF-C in the three groups. Observation was made on influence by ES on gene expression of LYVE-1 and VEGF-C in nude mice bearing tumor. Results Group A and group B had serum VEGF-C level respectively as (155.26±10.24) and (180.23±15.64) pg/L, which were all higher than (103.15±13.20) pg/L in group C, and their difference had statistical significance (P<0.01). Group A had lower serum VEGF-C level than group B, and their difference had statistical significance (P<0.05). Group A and group B had serum LYVE-1 level respectively as (65.32±16.29) and (90.58±10.67) pg/L, which were all higher than (28.31±10.36) pg/L in group C, and their difference had statistical significance (P<0.01). Group A had lower serum LYVE-1 level than group B, and their difference had statistical significance (P<0.05). Group A and group B both had higher PCR expanding fold of tissue LYVE-1 and VEGF-C than group C, and the difference had statistical significance (P<0.01). Group A had lower PCR expanding fold of tissue LYVE-1 and VEGF-C than group B, and the difference had statistical significance (P<0.05). Conclusion Intervention by recombinant ES for nude mice bearing TE-1 esophageal squamous carcinoma showed that recombinant ES can not only inhibit neovascularization in tumor, but also show inhibiting effect for lymphangiogenesis in tumor through inhibition of VEGF-C and LYVE-1 in tumor tissue.

【Key words】 Recombinant endostatin; Vascular endothelial growth factor-C; Lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1; Esophagus cancer; Transplanted tumor model

食管癌是我國常见的恶性肿瘤之一, 肿瘤血管形成在食管癌的发生、发展中起着非常重要的作用[1]。重组ES是一种新型人ES和抗肿瘤血管生成药物, 本研究通过重组ES对TE-1食管鳞癌细胞荷瘤裸鼠的干预, 检测成瘤裸鼠VEGF-C和LYVE-1的表达水平, 研究重组ES是否对肿瘤新生淋巴管有调节作用。现报告如下。

1 材料与方法

1. 1 材料 ①BALB/c雄性裸鼠(SPF清洁级)18只, 5~6周龄, 购于北京中国医学科学院实验动物研究所, 饲养于长治医学院实验动物中心SPF清洁级环境。TE-1食管鳞癌细胞购于中国科学院细胞库(上海细胞库)。②细胞培养试剂RPMI1640培养基、胰蛋白酶购于Hyclone公司;胎牛血清(FBS)购于杭州四季青公司;注射用青霉素钠100万单位、注射用硫酸链霉素100万单位购于华北制药股份有限公司;重组ES购于先声烟台麦得津生物工程股份有限公司。小鼠VEGF-C和LYVE-1 Elisa Kit购于上海酶联生物。③HyPure TMMolecular Biology Grade Water购于HyClone公司;RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit购于Thermo公司;FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)购于Roche公司;RNA提取液购于武汉谷歌生物科技有限公司;引物由武汉擎科创新生物科技有限公司合成。

1. 2 方法

1. 2. 1 细胞及动物培养 TE-1食管鳞癌细胞复苏后用RPMI1640培养基和10% FBS在37℃、5% CO2条件下培养。收集对数生长期TE-1细胞, 用生理盐水重悬制成1×107/ml的瘤细胞悬液。取12只BALB/c雄性裸鼠在其左侧腹股沟中上部皮下接种瘤细胞悬液0.1 ml/只。每日观察裸鼠成瘤情况及生活状态, 隔日用游标卡尺测量肿瘤的大小。最后根据以下公式计算肿瘤体积:肿瘤体积﹦1/2×长径×短径。

1. 2. 2 实验动物分组及处理 待裸鼠皮下肿瘤生长到长径约0.7 cm时, 随机把荷瘤裸鼠分为2组, 每组6只。A组:治疗组, 隔日瘤周皮下多点注射ES稀释液, 注射剂量为10 mg/kg, 共28 d。B组:对照组, 隔日瘤周皮下多点注射生理盐水, 共28 d。另6只正常裸鼠作为C组。处死裸鼠前测量肿瘤的大小、裸鼠的体重;并裸鼠尾静脉采血约0.5 ml/只。处死裸鼠后取出肿瘤组织、称重;并解剖裸鼠, 观察肿瘤转移情况。根据不同的用途处理肿瘤组织。

1. 2. 3 总RNA抽提 ①组织标本匀浆:取匀浆器, 加入1 ml的RNA提取液, 置冰上预冷;取100 mg组织, 加入到匀浆器中, 充分研磨直至无可见组织块;12000 r/min离心10 min

取上清。②加入250 μl三氯甲烷, 颠倒离心管15 s, 充分混匀, 静置3 min。③4℃ 下12000 r/min离心10 min;将上清转移到一新的离心管中, 加入0.8倍体积的异丙醇, 颠倒混匀;-20℃ 放置15 min。④4℃下12000 r/min离心10 min, 管底的白色沉淀即为RNA;吸除液体, 加入75%乙醇1.5 ml洗涤沉淀;4℃下12000 r/min离心5 min。⑤将液体吸除干净, 将离心管置于超净台上吹3 min;加入15 μl无RNA酶的水溶解RNA;55℃ 孵育5 min。

1. 2. 4 荧光定量PCR(SYBR Green染色法)引物的设计 根据GenBank提供的小鼠VEGF-C(216bp)、LYVE-1 mRNA序列(81bp), 采用Primer E×press 2.0软件进行引物和探针的设计并经Blast验证。内参GAPDH参照文献[1]合成。见表1。

1. 2. 5 反转录 取PCR管, 加入含2 μg RNA的溶液;加入1 μl oligo(dT)18;用无核糖核酸酶的去离子水补足至12 μl;于PCR仪上65℃ 保温5 min, 迅速置冰上冷却;依次加入4 μl

5×buffer, 2 μl 10 mM dNTPs, 1 μl RNA inhibitor和1 μl 反转录酶, 用枪抽吸混匀;于PCR仪上42℃保温60 min, 结束后80℃保温5 min灭活反转录酶。

1. 2. 6 定量PCR 取0.2 ml PCR管, 配制如下反应体系, 每个反转录产物配制3管:2×qPCR Mix 12.5 μl;7.5 μM基因引物2.0 μl;反转录产物2.5 μl;ddH2O 8.0 μl。

PCR反应条件:94℃预变性10 min;95℃ 15 s、60℃ 60 s扩增40个循环;溶解曲线75℃→95℃, 每20 s升温1℃。

1. 2. 7 血清VEGF-C及LYVE-1检测 小鼠血清VEGF-C和LYVE-1的检测严格按照试剂盒说明书进行。

1. 3 观察指标 比较三组血清LYVE-1、VEGF-C的表达水平, 观察ES对荷瘤裸鼠LYVE-1和VEGF-C基因表达的影响。

1. 4 统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差( x-±s)表示, 采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 裸鼠血清LYVE-1和VEGF-C的表达水平 A、B组血清VEGF-C水平分别为(155.26±10.24)、(180.23±15.64)pg/L,

均高于C组的(103.15±13.20)pg/L, 差异具有统计学意义(P<0.01);A组血清VEGF-C水平低于B组, 差异具有统计学意义(P<0.05)。A、B组血清LYVE-1水平分别为(65.32±16.29)、(90.58±

10.67)pg/L, 均高于C組的(28.31±10.36)pg/L, 差异具有统计学意义(P<0.01);A组血清LYVE-1水平低于B组, 差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2. 2 ES对荷瘤裸鼠LYVE-1和VEGF-C基因表达的影响 A、B组组织内VEGF-C的PCR扩增倍数均高于C组, 差异具有统计学意义(P<0.01);A组组织内VEGF-C的PCR扩增倍数低于B组, 差异具有统计学意义(P<0.05)。A、B组组织内LYVE-1的PCR扩增倍数均高于C组, 差异具有统计学意义(P<0.01);A组组织内LYVE-1的PCR扩增倍数低于B组, 差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

3 讨论

食管癌是常见的恶性肿瘤, 除外血道转移, 经淋巴转移也是重要的转移途径。早在1971年Folkman就提出肿瘤生长依赖新生血管生成, 可以通过抑制肿瘤新生血管生成而达到治疗肿瘤的目的[2]。重组ES通过抑制细胞乏氧诱导因子1-α(Hypoxia Inducible Factor-1α, HIF-1α)和VEGF表达来抑制肿瘤新生血管的生成[3]。LYVE-1是1999年分离鉴定的第一个淋巴管内皮细胞特异的透明质酸受体[4], 仅仅表达于淋巴管内皮细胞, 在血管内皮细胞不表达。由于LYVE-1特异性好, 是比较可靠的淋巴管内皮细胞标志物, 被广泛应用于淋巴管生成的研究。VEGF家族成员VEGF-C通过VEGF-C/VEGFR-3信号通路介导肿瘤淋巴管生成和肿瘤经淋巴转移[5]。因此本研究通过重组ES对TE-1食管鳞癌细胞荷瘤裸鼠的干预, 检测成瘤裸鼠VEGF-C和LYVE-1的表达水平, 研究重组ES是否对肿瘤新生淋巴管有调节作用。

肿瘤淋巴管生成是指淋巴内皮细胞在肿瘤组织内或肿瘤组织周围形成新生的毛细淋巴管, 而毛细淋巴管的生成过程非常复杂, 受多种细胞因子和信号传导通路的协同调控[6], 目前对其机制了解较少。但是在肿瘤淋巴管的生成过程中, VEGF-C和LYVE-1被认为发挥重要的调节作用。

淋巴管是肿瘤发生淋巴转移的重要通道, 但迄今为止通过淋巴转移的机制尚未完全阐明。VEGF-C能促进淋巴管内皮细胞分泌趋化因子, 趋化因子与肿瘤细胞上的相应受体结合, 诱导肿瘤细胞向淋巴管内皮细胞趋化和粘附, 为肿瘤的淋巴转移创造条件[7]。

LYVE-1是淋巴管内皮上的I型膜蛋白, 主要分布在淋巴管内外腔。LYVE-1在区分肿瘤组织与正常组织中的淋巴管有重要意义, 它能反映肿瘤相关淋巴管的密度, 可以联合其他指标判断肿瘤的转移及预后[8-10]。

LYVE-1染色阳性管腔视为微淋巴管, 即微淋巴管密度(MLVD)。在TE-1食管鳞癌细胞荷瘤裸鼠的既往干预实验中, 发现无论在肿瘤组织还是瘤旁组织, ES治疗组明显低于非治疗组。而且ES治疗组与非治疗组裸鼠肿瘤组织中VEGF-C表达与MLVD间均存在正相关。以上结果从免疫组化及半定量研究说明重组ES可能通过抑制肿瘤组织内VEGF-C的表达, 而对肿瘤新生淋巴管的发生起到抑制作用。

同样在重组ES对TE-1食管鳞癌细胞荷瘤裸鼠的干预实验中, A、B组血清VEGF-C、LYVE-1水平均高于C组, 差异具有统计学意义(P<0.01);A组血清VEGF-C、LYVE-1水平低于B组, 差异具有统计学意义(P<0.05)。这些实验数据是既往的实验研究结果的补充和拓展。

综上所述, 通过重组ES对TE-1食管鳞癌细胞荷瘤裸鼠干预, 重组ES不仅抑制肿瘤新生血管的生成, 而且重组ES可能通过抑制肿瘤组织内VEGF-C和LYVE-1的表达, 而对肿瘤新生淋巴管的发生起到抑制作用。相信随着对VEGF家族研究的深入, 重组ES对临床食管癌的治疗机制必将增添新的基础研究证据。

参考文献

[1]Jesmin S, Zaedi S, Yamaguchi N, et al. Effects of dual endothelin receptor antagonist on antiapoptotic marker Bcl-2 expression in streptozotocin-induced diabetic rats. Exp Biol Med (Maywood), 2006, 231(6):1034-1039.

[2]Eo JS, Jeong JM. Angiogenesis Imaging Using (68)Ga-RGD PET/CT: Therapeutic Implications. Semin Nucl Med, 2016, 46(5):419-427.

[3]Roman J, Ritzenthaler JD, Roser-Page S, et al. alpha5beta1-integrin expression is essential for tumor progression in experimental lung cancer. Am J Respir Cell Mol Biol, 2010, 43(6):684-691.

[4]Du Y, Liu H, He Y, et al. The interaction between LYVE-1 with hyaluronan on the cell surface may play a role in the diversity of adhesion to cancer cells. PLoS One, 2013, 8(5):e63463.

[5]Ran S, Volk L, Hall K, et al. Lymphangiogenesis and lymphatic metastasis in breast cancer. Pathophysiology, 2010, 17(4):229-251.

[6]Bu S, Wang Q, Zhang Q, et al. Human endometrial mesenchymal stem cells exhibit intrinsic anti-tumor properties on human epithelial ovarian cancer cells. Sci Rep, 2016, 6:37019.

[7]Schulte-Merker S, Sabine A, Petrova TV. Lymphatic vascular morphogenesis in development, physiology, and disease. J Cell Biol, 2011, 193(4):607-618.

[8]尚立群, 赵皆, 王伟, 等. 重组人血管内皮抑素对非小细胞肺癌淋巴管生成的抑制及对循环肿瘤细胞的影响. 中国肺癌杂志, 2014(10):722-729.

[9]程璐, 林岩, 曹鹏, 等. 重组人生长激素对荷人胃癌裸鼠移植瘤血管内皮生长因子表达的影响. 中华临床营养杂志, 2010, 18(2):101-105.

[10]孙志强, 于静萍, 张志明, 等. 重组人血管内皮抑素对食管癌细胞的放射增敏作用及其机制. 中华放射医学与防护杂志, 2013, 33(4):346-350.

[收稿日期:2017-04-12]

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