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激活AMPK通过下调microRNA⁃21水平抑制肺癌细胞增殖及侵袭能力

作者: | 发布时间:2022-11-02 16:12:01 | 浏览次数:


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【摘要】  目的 探讨激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是否可抑制人肺腺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭及其具体作用机制,为防治肺癌寻求新靶点。方法 以培养的人A549肺腺癌细胞株为研究对象,外源性给予AMPK激动剂二甲双胍干预细胞,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞的增殖情况,采用逆转录(RT)⁃PCR法检测各组细胞微小RNA⁃21(miR⁃21)水平,蛋白免疫印迹法检测各组细胞p⁃/t⁃AMPK、PTEN、p⁃/t⁃Akt水平,Transwell实验检测迁移及侵袭情况。结果 二甲双胍可抑制A549细胞增殖、迁移及侵袭能力,对穿膜细胞数计数后进行统计学分析,组间存在差异(P均<0.05,与对照组比较);二甲双弧可通过激活AMPK下调细胞miR⁃21水平,上调PTEN表达,抑制Akt活性抑制A549细胞增殖及迁移侵袭(P均<0.05,与对照组比较);转染miR⁃21 mimics可逆转AMPK的作用(P均<0.05,与二甲双胍组比较)。结论 通过上调PTEN表达,下调miR⁃21水平可抑制A549细胞的增殖及迁移侵袭,提示激活AMPK具有潜在治疗肺癌的作用,为研发新的靶向治疗药物提供了思路。

【关键词】  肺癌;腺苷酸活化蛋白激酶;微小核糖核酸⁃21;PTEN

【Abstract】  Objective  To discuss whether the activation of AMP⁃activated protein kinase(AMPK)can inhibit the proliferation,migration and invasion of A549 cells and uavel the underlying mechanism,aiming to provide a novel target for lung cancer therapy. Methods  Human lung adenocarcinoma A549 cells were intervened with the AMPK agonist of metformin. MTT assay was applied to analyze the proliferative ability of tumor cells in different groups. qRT⁃PCR was utilized to measure the expression level of microRNA⁃21 (miR⁃21). Western blot was performed to detect the expression levels of p⁃/t⁃AMPK,PTEN and p⁃/t⁃Akt proteins. Transwell invasion assay was utilized to analyze the migration and invasion of A549 cells. Results  Metformin could inhibit the proliferation,migration and invasion of A549 cells. The quantity of trans⁃membrane cells significantly differed among different groups (all P<0.05,compared with the control group). Metformin could down⁃regulate the expression level of miR⁃21,up⁃regulate the expression level of PTEN,suppress the Akt activity and inhibit the proliferation,migration and invasion of A549 cells by activating the AMPK signaling pathway (all P<0.05,compared with the control group). Transfection with miR⁃21 mimics reversed the effect of AMPK (all P<0.05,compared with the metformin group). Conclusions  Metformin inhibits the proliferation,migration and invasion of A549 cells by up⁃regulating the expression of PTEN and down⁃regulating the expression of miR⁃21,prompting that activating the AMPK signaling pathway serves as a potential therapeutic target to treat lung cancer,providing evidence for exploring novel target medicines.

【Key words】  Lung cancer;AMP⁃activated protein kinase;MicroRNA⁃21;PTEN

原发性支气管肺癌(以下简称肺癌)是当今世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,发病率及病死率均高居首位,严重威胁人类生命健康。据统计近年来我国新发肺癌病例数73.33万(男性50.93万,女性22.40万),因肺癌死亡人数达到61.02万(男性43.24万,女性17.78万)[1]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)被认为是真核生物的“细胞能量调节器”,可调节下游通路中与胆固醇代谢、脂肪酸合成及蛋白质合成相关基因的表达,发挥其能量调节器的功能[2]。近年来的研究表明,激活AMPK信号通路对肿瘤生长和存活有抑制作用。实体肿瘤中,AMPK活性往往较低。Zheng等[3]研究发现,肝癌中AMPK虽然有表达,但其活性缺失却是一个普遍存在的现象。目前的研究显示AMPK有望成为非小细胞肺癌治疗的靶点,但其具体的分子机制仍需要进一步的探究[4]。本研究以培养的人A549肺腺癌细胞株为研究对象,外源性给予AMPK激动剂二甲双胍干预细胞,通过MTT、逆转录(RT)⁃PCR、蛋白免疫印迹法及Transwell等方法研究二甲双胍对人肺腺癌细胞株A549增殖、迁移侵袭以及对microRNA-21(miR⁃21)水平及其下游PTEN?PI3K/Akt信号通路的影响,旨在为论证激活AMPK作为治疗肺癌的潜在途径提供依据。

材料与方法

一、细胞株和试剂选择

人A549肺腺癌细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库,二甲双胍购自Selleck,Compound C 购自Merck Millipore ,RNA提取试剂盒购自陕西先锋生物科技有限公司,逆转录试剂盒及TaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司,PTEN、p⁃Akt、t⁃Akt、p⁃AMPK、t⁃AMPK、GAPDH抗体购自CST,细胞培养板购自Corning,PCR扩增仪及Western电泳仪购自BIO⁃RAD,MTT试剂购自西唐生物科技有限公司。

二、试验方法

1. 细胞培养

A549细胞用含有10%灭活胎牛血清,青霉素(100 U/ml),链霉素(100 μg/ml)的DMEM培养基,置于37℃、5% CO2 培养箱中培养。

2.   噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性

将处于对数生长期的A549细胞消化贴壁细胞后,加入含10%血清的培养基,制成单细胞悬液并计数,以约6×103个/孔细胞数接种于96孔培养板中,将培养板放入37℃、5% CO2培养箱内孵育24 h,细胞全部贴壁后,弃去上清,取出96孔板,每孔加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl,然后置于37℃ 、5% CO2培养箱中继续孵育4 h,弃去上清,每孔加DMSO 150 μl,置于摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解;设定空白对照孔调零,选择490 nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔的光吸收值(OD值)。并计算平均增殖率,增殖率=实验孔OD值/对照孔OD值×100%,整理保存数据。

3.   RT⁃PCR检测miR⁃21水平

用RNAfast1000⁃总RNA极速抽提试剂盒提取细胞总RNA,配制逆转录cDNA反应液用于miR⁃21及U6的检测,将逆转录好的cDNA稀释10倍至50 ng/μl以下应用BIO⁃RAD PCR實时定量扩增仪的操作方法进行反应,分析溶解曲线,计算结果。

4.   蛋白免疫印迹法检测细胞内PTEN及p⁃Akt水平

按实验设计干预细胞后提取蛋白,用BCA法测定蛋白含量、变性,SDS⁃PAGE电泳,转印后取出硝酸纤维素膜进行免疫反应,膜用滤纸吸干,将预先配制的发光液均匀滴上,BIO⁃RAD成像系统检测条带,分析结果。

5.   Transwell小室迁移及侵袭实验测定肿瘤细胞迁徙及侵袭能力

用Matrigel胶与无血清培养基按1∶7稀释,每个Transwell小室上加入100 μl稀释液,37 ℃孵育箱孵育 Transwell 小室至少1 h 使胶凝固,制备细胞悬液,在细胞培养箱中常规培养(迁移实验培养24 h,侵袭实验培养48 h),显微镜下取小室的上、下、左、右、中心5个视野部位计数,统计结果。

三、统计学处理

采用SPSS 18.0统计分析。正态分布数据以x±s表示,2组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,多重比较采用LSD⁃t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、二甲双胍抑制肺癌细胞的侵袭能力

将A549细胞分为对照组、二甲双胍组,进行Transwell迁移及侵袭试验,结果显示二甲双胍干预后,A549细胞的迁移及侵袭能力明显受到抑制。对穿膜细胞数计数后进行统计分析,组间差异有统计学意义(P<0.05),见图1。

二、二甲双胍通过激活AMPK抑制肺癌细胞增殖和侵袭能力

将A549细胞分为对照组及二甲双胍组,提取细胞总蛋白,蛋白免疫印迹法检测各组细胞p⁃AMPK水平,与对照组比较,二甲双胍组p⁃AMPK水平明显升高(图2A,P<0.05)。预先给予AMPK抑制剂Compound C可抑制二甲双胍诱导的p⁃AMPK水平上调(P<0.05,图2B)。MTT检测细胞增殖情况,结果表明特异性抑制AMPK,二甲双胍抑制A549细胞增殖的作用被逆转(图2C,P<0.05,与二甲双胍组比较)。

预先给予AMPK抑制剂Compound C可逆转二甲双胍抑制A549细胞迁移及侵袭的能力。对穿膜细胞计数后进行统计分析,组间差异有统计学意义(图3,P<0.05,与二甲双胍组比较)。

三、激活AMPK抑制肺癌细胞增殖和侵袭能力的分子机制

1. miR⁃21水平

与对照组相比,二甲双胍干预可下调细胞中miR⁃21水平(P<0.05),而预先给予AMPK抑制剂Compound C可逆转二甲双胍对miR⁃21水平的影响(图4,P <0.05,与二甲双胍组比较)。

2. PTEN/PI3K/Akt信号通路

与对照组相比,二甲双胍干预可明显上调细胞中PTEN水平,而预先抑制AMPK可逆转二甲双胍对PTEN水平的影响;二甲双胍干预可下调A549细胞中p⁃Akt水平,而预先给予Compound C 可以逆转二甲双胍对p⁃Akt的抑制作用,见图5。

3.  miR⁃21介导了激活AMPK抑制肺癌细胞增殖的作用

为了进一步明确激活AMPK是否通过下调miR⁃21水平抑制A549细胞增殖。用miR⁃21 mimics转染A549细胞,培养48 h后提取总RNA,qRT⁃PCR检测细胞miR⁃21水平。结果表明miR⁃21 mimics可明显上调A549细胞中miR⁃21水平(图6A,P<0.05,与对照组比较)。二甲双胍处理可明显抑制A549细胞增殖(P<0.05,与对照组比较),而预先给予miR⁃21 mimics可逆转二甲双胍抑制细胞增殖的作用(P<0.05,与二甲双胍组比较),见图6B。

为了进一步明确激活AMPK是否通过下调miR⁃21水平抑制A549细胞侵袭,将A549细胞分为对照组、二甲双胍组、miRNA mimics NC+二甲双胍组、miR⁃21 mimics +二甲双胍组,Transwell小室实验检测肺癌细胞迁移及侵袭能力。结果表明二甲双胍处理可明显抑制A549细胞迁移及侵袭,而预先给予miR⁃21 mimics可逆转二甲双胍的抑制作用,对穿膜细胞计数后进行统计分析,组间比较差异有统计学意义(图7,P<0.05,与二甲双胍组比较)。

将A549细胞分为对照组、二甲双胍组、miRNA mimics NC+二甲双胍组、miR⁃21 mimics +二甲双胍组。miRNA mimics NC或miR⁃21 mimics 预转染细胞24 h,然后加入10 ml吡格列酮干预24 h,提取蛋白质,检测PTEN和p⁃/t⁃Akt水平。结果显示二甲双胍处理可上调PTEN水平,而预先给予miR⁃21 mimics可逆转二甲双胍对PTEN水平的影响(图8A)。二甲双胍处理可下调p⁃Akt水平,而预先给予miR⁃21 mimics可逆转二甲双胍对p⁃Akt水平的影响(图8B)。

讨 论

miR⁃21基因是最早在人类基因组中检测到的miRNA之一,在多种不同类型肿瘤组织中均明显上升,与肿瘤细胞的增殖、迁移侵袭、血管生成和抗药性等生物学行为相关,在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。近年来,miR⁃21在肺癌发病和治疗过程中的作用逐渐引起关注[5⁃9]。PTEN是miR⁃21的重要靶蛋白之一,miR⁃21可以通过下调PTEN水平诱导多种细胞增殖。PI3K/Akt信号通路参与细胞增殖、迁移、分化、血管生成等一系列病理生理过程。研究表明,Akt可通过磷酸化调控下游靶蛋白的活性或功能[10⁃11]。例如,Akt可磷酸化双微基因2蛋白,抑制p53蛋白的功能,促进细胞存活;可通过磷酸化BAD、FXKR抑制其生物活性,抑制细胞凋亡;促进NF⁃κB磷酸化,抑制细胞凋亡;可通过磷酸化mTOR,上调Skp2水平,下调p27,促进细胞增殖。本研究未系统检测Akt下游关键靶蛋白的活性变化,但大量的研究已建立了它们之间的相关性。

作为肿瘤重要的恶性生物学行为之一,迁移及侵袭加剧了肿瘤的发展进程,影响预后。研究发现在胰腺癌中miR⁃21表达的上调,加剧了肿瘤细胞的迁移及侵袭[12]。本研究中,Transwell实验结果证实过表达miR⁃21可以逆转二甲双胍对A549细胞迁移及侵袭能力的抑制作用。

综上所述,二甲双胍可通过激活AMPK下调miR⁃21水平,进而负性调控PTEN⁃PI3K/Akt信号通路抑制肺癌细胞增殖;此外,二甲双胍还可抑制肺癌细胞的侵袭能力,机制也與激活AMPK,下调miR⁃21水平有关,提示AMPK可能是防治肺癌的新靶点,但要应用于临床过程,尚需进一步研究、验证。

参 考 文 献

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(收稿日期:2018⁃07⁃10)

(本文编辑:杨江瑜)

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