盐负荷和醛固酮诱导乳鼠原代心肌细胞肥大的实验研究

[摘要] 目的 探讨盐负荷和醛固酮对乳鼠原代心肌细胞肥大的协同作用。 方法 原代培养乳鼠心肌细胞，随机分为正常对照组、醛固酮10～7 mol/L（Ald）组、等钠浓度140 mmol/L（NS）组、高钠浓度146 mmol/L（HS）组、等钠浓度140 mmol/L+Ald 10～7 mol/L（NS+Ald）组、高钠浓度146 mmol/L+Ald 10～7 mol/L（HS+Ald）组；其中NS+Ald与HS+Ald组先不加Ald，培养48 h后，加入Ald，所有处理组继续培养24 h。免疫荧光法测定心肌细胞横截面积差异，细胞活性实验（CCK-8）检测其活性，流式细胞仪检测细胞凋亡率，荧光定量PCR检测内皮素-1（ET-1）、一氧化氮合酶（eNOS）mRNA表达的差异。 结果 NS+Ald组及HS+Ald组心肌细胞横截面积较Ald组、NS组、 HS组明显增加（P < 0.01）；与正常对照组比较，NS+Ald组及HS+Ald组心肌细胞存活率明显下降（P < 0.01）、凋亡率显著上升（P < 0.01）；除NS组外，余组ET-1 mRNA表达升高，eNOS mRNA表达下降，以HS+Ald组最为显著（P < 0.01）。 结论 盐负荷和醛固酮是诱导心肌细胞肥大的重要参与因子，具有协同作用；其中以高盐状态下，醛固酮诱导的心肌细胞肥大最为显著。

[关键词] 盐负荷；醛固酮；心肌细胞；基因表达；凋亡

[中图分类号] R332 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）10（a）-0013-04

[Abstract] Objective To investigate the synergistic effects of salt loading and aldosterone on hypertrophy of primary cardiomyocytes in neonatal rats. Methods Neonatal rat cardiomyocytes were culturedin the experiment， the cell was divided into normal control group， Aldosterone 10-7 mol/L （Ald） group， normal sodium concentration 140 mmol/L （NS） group， high sodium concentration 146 mmol/L （HS） group， 140 mmol/L+Ald 10-7 mol/L （NS+Ald） group， 146 mmol/L+Ald 10-7mol/L （HS+Ald） group. At first Ald was not added into （NS+Ald） group and （HS+Ald） group， after 48 h culture， Ald was added， then all treatment groups were continued to culture for 24 h. The difference of myocardial cross-sectional area was measured by immunofluorescence. The survival rate was detected by CCK-8. The apoptosis rate was detected by flow cytometry. ET-1 and eNOS mRNA expressions were assayed by qRT-PCR. Results The cross-sectional area of myocardial cells in NS+Ald group and HS+Ald group were significantly higher than Ald group， NS group， HS group. Compared with normal control group， the survival rate of cardiomyocytes decreased significantly （P < 0.01） and apoptosis rate increased significantly （P < 0.01） in NS+Ald group and HS+Ald group； except for NS group， ET-1 mRNA expression increased and eNOS mRNA expression decreased in other groups， the effect of HS+Ald group was the most significant （P < 0.01）. Conclusion Salt loading and aldosterone are important participation factors which induced cardiomyocyte hypertrophy， they have synergistic effects. Among them， aldosterone-induced cardiomyocyte hypertrophy is the most significant in high salt condition.

[Key words] Salt load； Aldosterone； Myocardial cell； Gene expression； Apoptosis

高鹽饮食（摄盐量≥6.25 g/d）是新疆哈萨克族牧民高血压患病率的重要危险因素[1-2]。动物实验结果显示，盐负荷是导致心血管疾病和靶器官损伤的重要原因[3-4]；同时，醛固酮（Ald）也可引起心室重构及血压的变化，食盐在其间发挥的作用不容忽视[5]，故预防和逆转心脏结构功能受损是高血压防治的重要途径。但盐负荷和醛固酮如何导致心肌细胞的生物学改变、对心肌细胞肥大是否具有协同作用，是否加速心肌细胞损伤仍是研究的热点。基于此，本研究从体外实验探讨食盐和醛固酮作用于心肌细胞后，其横截面积、活力、凋亡率及参与血管微循环基因的表达差异，为深入研究食盐和醛固酮对心肌细胞的生物学改变提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD新生乳鼠，日龄1～3 d，SPF级，体重6～8 g [动物生产许可证号：SCXK（新）2011-0004]，于新疆医科大学实验动物中心饲养，实验通过新疆医科大学第一临床附属医院伦理委员会审核（伦审号：20140304-150）；实验动物SPF环境使用许可证号：SYXK（新）2011-0004，动物合格证号：No.65000700000650。

1.2 材料与试剂

氯化钠（分析纯）：天津科密欧公司配置：①1 mol NaCl = 58.5 g；②将81.9 mg的NaCl溶于100 mL双蒸水，高温消毒灭菌；③取10 μL上述盐溶液加入90 μL培养液中即得到终浓度为140 mmol/L（正常范围）的NaCl溶液，同法配置146 mmol/L（生理环境下高钠浓度）溶液；DMEM培养基（高糖）：Hyclone公司；醛固酮、0.4%台盼蓝：Sigma公司；胎牛血清：美国Gibco公司；抗心肌肌钙蛋白T抗体：Abcam公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒：BD公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）：日本同仁公司。

1.3 心肌细胞的培养及鉴定

采用陶静等[6]的方法培养乳鼠心肌细胞并进行鉴定，鉴定采用抗心肌肌钙蛋白T抗体、免疫荧光法进行。取生长良好，0.4%台盼蓝染色，细胞的成活率>98%可行后续实验。

1.4 免疫荧光法测定盐负荷和醛固酮对心肌细胞横截面积的影响

以1×105/mL将心肌细胞接种于6孔板，3个复孔/组，24 h后DMEM培养液同步化细胞；实验分为正常对照组、醛固酮10～7 mol/L（Ald）组、等钠浓度140 mmol/L（NS）组、高钠浓度146 mmol/L（HS）组、等钠浓度140 mmol/L+Ald 10～7mol/L（NS+Ald）组、高钠浓度146 mmol/L+Ald 10～7 mol/L（HS+Ald）组；其中NS+Ald组与HS+Ald组先不加Ald，培养48 h后，再加入Ald，所有处理组继续培养24 h。余操作同细胞鉴定，荧光显微镜观察细胞形态。实验重复3次，ImageJ 1.46r软件计算心肌细胞面积。

1.5 CCK-8法实验检测心肌细胞存活率

以5×104/mL将心肌细胞接种于96孔板，分组同“1.4”，不同实验组同步化细胞72 h，设立不加细胞的调零孔，按试剂盒说明书添加CCK-8溶液并检测吸光度。6个复孔/组，实验重复3次。细胞存活率（%）=[A（不同处理）-A（调零）]/[A（正常对照）-A（调零）]×100%。

1.6 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率

细胞分组同“1.4”，收集上清液。测定及结果判断按Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书进行[7]。

1.7 qRT-PCR检测不同处理组的心肌细胞中内皮素 -1（ET-1）、一氧化氮合酶（eNOS）mRNA表达的影响

细胞分组同“1.4”。①提取总RNA，电泳对所得RNA检测其完整性，OD260∶280在1.8～2.0为符合浓度及纯度。②逆转录聚合酶链式反应，引物由上海生工生物公司采用Batch Primer 3软件设计并合成，序列为（5"～3"）：ET-1上游：CTGGACATCATCTGGGTCAA，下游：CTGTTCCCTTGGTCTGTGGT；eNOS上游：TTCCGGCTGCCACCTGATCCTAA，下游：AACATGTGTCCTTGCTCGAGGCA；GAPDH（内参基因）上游：GAAG？鄄GGCTCATGACCACAGT，下游：GGATGCAGGGATGAT？鄄GTTCT。cDNA按逆转录试剂盒说明书进行，反应条件：合成变性94℃ 3 min，扩增94℃ 30 s，退火30 s（ET-1 55.0℃；eNOS 54.0℃；GAPDH 55.0℃），延伸72℃45 s，30次循环，终末延伸72℃ 10 min。待测基因mRNA相对表达量（2-ΔΔCT）=待测基因/GAPDH比值。IQ5 Real Time PCR系统进行检测。

1.8 统计学方法

采用统计软件SPSS 16.0对数据进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验及Tukey法。两组之间相关性采用Pearson相关分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同细胞条件培养液对心肌细胞横截面积的差异比较

免疫荧光结果（图1，封四）示，72 h后，与正常对照组比较，Ald组、NS组心肌细胞的横截面积无明显变化，HS组横截面积有轻度增加，差异无统计学意义（P > 0.05）；NS+Ald组及HS+Ald组的心肌細胞横截面积增加明显（P < 0.01）；LSD及Tukey法组间两两比较示，NS+Ald组、HS+Ald组心肌细胞横截面积明显大于Ald组/NS组/ HS组，差异有统计学意义（P < 0.01）；Ald组、NS组及HS组差异无统计学意义（P > 0.05）。Pearson相关分析显示，Ald组/NS组/HS组心肌细胞横截面积分别与NS+Ald组、HS+Ald组呈现明显的正相关（0.689≤r≤0.852，P < 0.01）。

2.2 不同细胞条件培养液对心肌细胞存活率的差异比较

与正常对照组比较，不同处理组的心肌细胞存活率有所下降，其中Ald组（87.27±0.06）%、NS组（93.75±0.21）%和HS组（89.04±0.14）%的细胞存活率差异无统计学意义（P > 0.05），NS+Ald组（77.64±0.11）%和HS+Ald组（67.97±0.12）%心肌细胞存活率显著降低（P < 0.01）。

2.3 不同细胞条件培养液对心肌细胞凋亡的影响

正常对照组与NS组均现少量的心肌细胞凋亡，与正常对照组比较，Ald组、HS组、NS+Ald组及HS+Ald组的心肌细胞存在不同程度的凋亡（P < 0.01），随着盐负荷增加，心肌细胞凋亡率明显上升；且给予醛固酮刺激后，心肌细胞凋亡率也显著上升。见图2。

2.4 不同细胞条件培养液对心肌细胞ET-1、eNOSmRNA表达的影响

qRT-PCR表明：与正常对照组比较，NS组ET-1 mRNA表达差异不大，Ald组、HS组、NS+Ald组和HS+Ald组ET-1 mRNA表达水平有所增加，除HS组外，其余组ET-1 mRNA表达明显增高（P < 0.05），其中以HS+Ald组最为显著（P < 0.01）（图3A）。eNOS mRNA表达呈现与ET-1 mRNA相反趋势，与正常对照组比较，除NS组eNOS mRNA表达无显著性差异外，Ald组、HS组、NS+Ald组和HS+Ald组eNOS mRNA表达均呈现下降趋势（P < 0.01或P < 0.05），其中以HS+Ald组最为显著（P < 0.01）（图3B）。

3 討论

研究提示，心脏系醛固酮的一个重要效应器官[8-10]，醛固酮可通过控制离子平衡来增加心肌细胞中Na+-K+-ATP酶、Na+内流及Na+-K+交换活性[11]；其中，心肌细胞中ET-1、eNOS等重要因子可通过肾素-血管紧张素系统调节心脏血液动力学导致血压的变化，从而促进心肌肥大，引起心肌重构。动物实验结果表明[12]，食盐量≤5 g/d时，醛固酮对心肌无任何损害作用，即食盐或许作为重要因素参与醛固酮作用的心肌细胞肥大，并起到协同作用。

心肌肥大是当心脏受到多种压力刺激下，长期超负荷工作所导致的一种慢性代偿性的病理改变[13]。实验结果显示了氯化钠与醛固酮对心肌细胞肥大的协同作用，分析原因为：心肌细胞内Na+浓度增加，激活胞内Na+/Ca2+交换体[14]，反向转运引起胞内Ca2+的超载、进入心肌细胞与其受体相结合，造成心肌结构重建、心肌细胞肥大。

心肌细胞凋亡是促使心肌细胞肥大失代偿期转化为心力衰竭至关重要的部分[15]。结果中，NS+Ald组和HS+Ald组的心肌细胞存活率及凋亡率变化最为显著，表明盐负荷和醛固酮的协同作用，导致心肌细胞出现广泛钠潴留、交感系统被激活、心肌细胞结构出现变异、心肌重塑，形成一个恶性循环[16]。

正常心肌细胞通过表达eNOS合成一氧化氮，持续抑制eNOS活性等导致eNOS缺失会引发实验鼠的心肌肥大[17-19]。ET-1是极具典型意义的血管活性物质，可与其特异性的受体结合，参与心肌肥大的病理过程[20]。本结果表明，eNOS的表达下调及ET-1表达上升可能为诱导心肌细胞肥大的作用靶点，盐与Ald[12]也可能是通过降低或抑制eNOS的表达来促进ET-1的表达上升，参与了心肌细胞肥大的发生、发展进程。

本研究观察盐负荷和醛固酮对心肌细胞的长期作用，显示盐负荷和醛固酮是诱导心肌细胞肥大产生的重要因子，具有协同作用，醛固酮在氯化钠的介导[12]下参与诱导心肌细胞肥大、诱发心肌细胞结构变异、使eNOS和ET-1基因表达平衡破坏，其中以高盐状态下，醛固酮产生的协同作用导致的心肌细胞肥大最为显著。

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（收稿日期：2017-07-06 本文编辑：苏 畅）

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